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单细胞核转录组测序

单细胞核转录组测序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）：通过提取样本单细胞核，然后分离、标记细胞核，在单细胞水平研究核基因表达检测的技术。为脑组织、心脏、肾脏等复杂组织或一些珍稀 冻存样品 提供了单细胞水平研究应用平台，可挖掘更多潜在的致病细胞类型，更易于探讨肿瘤细胞异质性和致病机理。

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单细胞悬液制备过程往往是造成实验可变性的主要因素。如何获得足质足量的单细胞悬液？这是实验面临的第一个难题，特别是那些稀有细胞或难以解离的细胞；细胞核膜相比细胞膜更为坚固，因此，冻存组织细胞膜破裂后细胞核则能够保持完整，由于仅涉及机械破碎和简单的纯化，snRNA-seq操作步骤相对简化，便于开展实验，其稳定性相比scRNA-seq大大提高。

单细胞核测序snRNA-seq由于是抽提细胞核进行测序，所以可以应用于冻存的样本，极大的利用了那些生理病理数据清晰的冻存样本；对于那些新鲜样本解离成功率低的样本；或者是样本的收集难度大，收集周期长，比如一个样本不同阶段的评估，或者根据治疗结果决定前端样本是否入组等情况；亦或是细胞体积大，形状不规则的样本都可以用snRNA-seq来解决。

因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，结果真实性提高。

直接对细胞进行机械法或者化学法破碎，不会引入解离偏好性，理论上来讲所有细胞类型都能得到回收，能够获得更加完整和全面的细胞图谱。

虽然有一些比较单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核（snRNA-seq）测序的研究表明，转录本在整个细胞和细胞核中的表达程度相当；理论上来讲，缺失了细胞质中的RNA分子，snRNA-seq在鉴定细胞转录状态中可能不如scRNA-seq，同时由于细胞核中带有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此对于某些样本而言，采用snRNA-seq每个细胞核中检测到的基因可能会有偏少的风险，不利于细胞亚型的鉴定。

虽然snRNA-seq能够获得更加全面完整的细胞类型，但是对于某些细胞类型的获得比例不如scRNA-seq，主要表现为免疫细胞。

Slyper, M., Porter, C.B.M., Ashenberg, O. et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med 26, 792–802 (2020).

以上这篇文章对8个肿瘤类型，同时进行scRNA-seq和snRNA-seq，结果发现：scRNA-seq数据中神经嵴、神经内分泌细胞大幅度减少、实质细胞大幅度减少；snRNA-seq数据中T细胞大幅度减少、B细胞和NK细胞消失、内皮细胞、上皮细胞增加。

这里主要讲一下核mRNA和细胞mRNA的区别：在细胞和里面主要有大量的pre-mRNA，这部分有内含子信息。一般的数据经验是PBMC内含子比对上的约为20%，核转录组45%。

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要理解这个过程，需要了解意向mRNA的形成和核运输的基本机制。同时要知道被我们捕获的PolyA是什么时候加到3‘端的。这里推荐阅读《基因X》。

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然后我们看看文章里面是如何做的：

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考虑到核mRNA的差异，在下游分析的时候还是有一些需要注意的地方的。

Habib, N., Avraham-Davidi, I., Basu, A. et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods 14, 955–958 (2017).

虽然单细胞核的平均表达谱与单个细胞的平均表达谱高度相关(Pearson r=0.87)，但在细胞核(如lncRNAs Malat1和Meg3)或细胞(线粒体基因Mt-nd1、Mt-nd2、Mt-nd4、Mt-nd4)中表达显著较高的基因(如lncRNAs Malat1和Meg3)或细胞(线粒体基因Mt-nd1、Mt-nd2、Mt-nd4、Mt-cytb)与已知的核与非核的明显富集相一致。

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单细胞核测序能不能测到 线粒体基因？ 让我们看一个实例：

Al-Dalahmah, O., Sosunov, A.A., Shaik, A. et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. acta neuropathol commun 8, 19 (2020).

Nuclei with percent exonic reads from all reads in the range of 25–75% were included. Nuclei with percent mitochondrial reads aligning to mitochondria genes of more than 14% were excluded. Genes were filtered by keeping features with  10 counts per row in at least in 31 cells.

虫子不吃的植物，人吃了对人身体是否有害？如转基因大豆。

最近黑龙江大豆协会公布了转基因大豆与癌症发病率具有高度相关性的官方说法，为反转基因宣传事业再次抹黑……大豆协会的报告毫无科学性可言，发布报告的官员基本上也没有什么科学素养，这报告多半是文科生鼓囊出来的。

不过，国际上对转基因大豆和玉米的副作用研究还是很多的。而且，除了我裆外，所有国家对转基因食品都抱有怀疑态度，包括早已经被孟山都攻陷的美国国会。下面列举几个例子：

1）转基因玉米等研制的初衷是美国希望制造低成本的工业酒精原料部分替代汽油。

2）美国人主要吃黄油（牛油），很少吃豆油，基本不吃豆制品，所以完全放开转基因大豆的种植和出口。

3）美国人的转基因玉米和转基因大豆主要作为饲料，部分食用也规定必须标注转基因成分。

4）美国联邦法官曾判决销毁转基因甜菜，后来在2012年末被孟山都翻案成功。

5）美国人的主食是小麦、鸡肉、牛肉、三文鱼之类，此类食品美国从未批准生产转基因类产品。

6）欧盟只批准了2种转基因作物种植，其中一种是转基因棉花。

7）除了天朝外的所有国家都在全力研究转基因食品的危害，包括泰国、印度、阿根廷和巴西之类的科技弱国。泰国甚至做出了一个深具影响力的研究，发现万亿分之一浓度的转基因农作物常用除草剂草甘膦能够致癌。

8）2008年5月28日，美国EPA（美国环境保护署）宣布拟定各商品内草甘膦（glyphosate）的残留许可限量（天朝对此残留无限制要求），详情请参考 美国联邦法规40 CFR§180.364

当然，转基因技术其实应该是未来农业生产的必由之路，这一点我是完全承认的。因为传统的农作物必须在“精耕细作”的管理下方能获得高产，而转基因作物只需要最低的人力成本。一个典型的例子是日本的国宝级经济学家大前研一（这人的研究我还是比较信服的）曾经去澳大利亚参观过一个农场，该农场平时只需要一个人维护（自动灌溉，飞机喷药除虫等），收割时再雇2个帮工，却可以提供整个日本1%的粮食产量。相比而言，天朝不到半亩农田勉强养活农户全家的种植方式成本自然低不下来。这正是因为这个道理，全球所有国家都不愿彻底抵制转基因——如果未来转基因确实能够成百倍降低农作物生产成本，那绝对是对人类有极大好处的事情。即便是现在，如果食品价格能够因转基因而降低，对政党的执政和政权维稳也有极大的好处——这也就是国外都规定严格标出食品中转基因成分的原因（国内基本本上只有大豆油是勉强标出是否转基因的，其他食品基本上不标，或只有部分厂家为广告原因标出非转基因），让消费者自己选择安全的，还是便宜的食品。

问题在于，转基因农作物的培育技术集中在美国孟山都和其兄弟企业德国巴斯夫公司手里。现在已经形成了极高的技术壁垒和自然垄断的现状。孟山都一贯以利润为首要目标，是一个和谷歌完（企业宗旨是不作恶）全相反的公司。多年来一直被滥用的糖精就是孟山都第一个以无毒添加剂为名引入中国的。而且孟山都的转基因技术独步全球，形成了绝对的技术垄断。美国有不少法律界学者一直抗议美国的知识产权法有漏洞，使得孟山都每次只需要改变一点点基因片段，就可以长期垄断某一个领域的转基因专利技术。这一点和美国的软件专利比较相似——智能终端方面，苹果和各个公司大打专利战靠的就是美国过度保护的知识产权法。其中典型的例子是，美国有个小公司刚刚起诉美国知名的游戏公司暴雪公司，称暴雪的网络游戏《魔兽世界》侵犯了其一个“在3D和联网环境下与NPC进行互动”的核心专利——如果这个起诉成功了，那么全世界的3D网游就都违反了该公司的专利（除非这个3D网游内没有NPC）。

孟山都的高度技术垄断导致了其可以不择手段牟利。我前面提到过，研究转基因农作物的初衷是为了研制出高产和低成本的制造工业用酒精来代替汽油。奥黑炭还曾将这个技术作为美国在金融危机中复苏的关键性战略。因此对于孟山都来说，有总统和国会的全力支持，转基因的安全性并不重要，重要的足够高产，足够便宜（人工费用和农药除草剂费用经可能低）。因此现在的转基因农作物，其主要功能是耐除草剂草甘膦，和对害虫有毒性。

抗虫基因我们已经比较熟悉了，理论上只对低等的昆虫肠道有毒性，对于高等动物无毒。虽然后来有实验认为对鸟类和猪还是有毒，但是蛋白质在煮熟后会变性，所以对于人类来说算是有双保险的。

问题在于草甘膦的毒性却是非常厉害的，而孟山都自己生产草甘膦，所以在转基因作物中大量添加耐草甘膦基因，以便于推广其草甘膦除草剂。

我们都知道，美国在越战时为了减少丛林作战，在越南投放了大量除草剂，造成了越南极大的生态灾难。无数越南新生儿发生变异畸形。草甘膦作为一种除草剂，孟山都是其主要生产公司，一直宣称它几乎无毒（照孟山都御用叫兽的说法，是可以当白开水喝）。美国政府出于种种目的，也与孟山都保持高度一致——其实美国政府非常关注药品安全，但不太在意食品安全。美国食品安全法规比天朝还宽松，甚至批准瘦肉精合法使用——当然天朝暗地里的用量远超美国。

关于草甘膦的危害，实验报告非常多，举不胜举。我随便举几个：

1,泰国研究发现，万亿分之一浓度的草甘膦致癌（泰国……天朝中科院和工程院的叫兽会不会有压力？），此外，这个研究结论倒可以解释前段时间广受质疑的法国关于转基因食品致癌实验中，转基因食品摄入量与癌症发病率不成正比的实验结果——因为仅万亿分之一即可致癌，法国人再减少摄入量也远远超过致癌量：

2,澳大利亚Flinders大学研究显示，转基因饲料导致猪胃部病变和子宫异常肥大（国外统计显示，草甘膦使猪发生严重肠胃炎的概率提高3倍）

3,喂养非转基因成分饲料牛的健康的胃与之比较喂养转基因成分饲料遭受慢性肉毒杆菌中毒的牛胃部解剖照片：

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4,草甘膦导致幼猪畸形和流产的案例照片（国外有案例，草甘膦使牛的流产率高达40%～50%）：

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5,喷洒草甘膦的作物和发生流产的猪、牛羊体内发现不明微生物的显微照片——因草甘膦能够破坏肠道正常益生菌的生存环境：

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6，转基因影响土壤微生物平衡和土壤肥力（美国生物战专家的报告）和其他毒性：

7，德国莱比锡大学研究发现是饲料草甘膦残留过高毒死德国牧场牛群

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大学生电商创业？

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